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前沿科技| 氨甲酰磷酸不同合成途径在大肠杆菌中的比较!

来源:国环检测 日期:2019-11-08 22:27 点击量:
  氨甲酰磷酸的合成具有极为重要的意义,本研究以大肠杆菌为材料,建立了细胞水平的氨甲酰磷酸检测体系。在此基础上,对氨甲酰磷酸合成的CPSⅡ途径与CK途径在全细胞催化水平进行了相应的比较和优化。优化后的CPSⅡ途径合成氨甲酰磷酸的能力优于CK途径,这为相关高附加值化合物的合成提供了一种更加高效的策略。

  1、背景

  氨甲酰磷酸是生物合成代谢中精氨酸与嘧啶的重要前体物质,在工业微生物生产精氨酸与嘧啶及其衍生物中发挥关键作用。

  2、目的

  在大肠杆菌Escherichia coli BW25113中比较氨甲酰磷酸不同合成途径的催化效率。

  3、方法

  在大肠杆菌Escherichia coli BW25113中过表达鸟氨酸氨甲酰基转移酶(OTC)的基础上,分别过表达大肠杆菌自身的氨基甲酸激酶(CK)和氨甲酰磷酸合酶(CPSⅡ)并表征其反应效果。通过优化底物供应(调整底物浓度与引入L-谷氨酰胺合成酶)对CK与CPSⅡ的催化反应进行优化。

  4、结果

  在大肠杆菌中过表达OTC,建立细胞水平氨甲酰磷酸检测体系。在此基础上比较不同来源的CK,发现大肠杆菌来源的CK效果最好,50 mmol/L NH4HCO3条件下全细胞催化9 h得到2.95±0.15 mmol/L L-瓜氨酸;过表达CPSⅡ时,50 mmol/L L-谷氨酰胺催化9 h得到3.16±0.29 mmol/L L-瓜氨酸。通过改变底物NH4HCO3浓度和引入外源L-谷氨酰胺合成酶(GS)等方式对CK与CPSⅡ的催化反应分别进行优化后,100 mmol/L NH4HCO3条件下,L-瓜氨酸浓度分别提高至4.67±0.55 mmol/L和6.12±0.38 mmol/L,且过表达GS后CPSⅡ途径可以利用NH3,不需要额外添加L-谷氨酰胺。

  5、结论

  【结论】引入L-谷氨酰胺合成酶后的CPSⅡ途径合成氨甲酰磷酸的能力优于CK途径,为精氨酸、嘧啶及其衍生物的合成提供了一种更加高效的策略。


  图1氨甲酰磷酸的不同合成途径与L-瓜氨酸合成途径


  图2 SDS-PAGE分析不同来源CK的蛋白表达(A)与催化能力比较(B)

  

  图3 SDS-PAGE分析CPSⅡ的蛋白表达(A)与催化效果(B)

 

  图4 NH4HCO3浓度对菌株ECFI合成氨甲酰磷酸的影响

  

  图5引入两岐双岐杆菌来源GS对CPSⅡ途径的影响(A),以及降低L-谷氨酰胺添加量对菌株GSABFI的影响(B)


  图6两种合成氨甲酰磷酸途径的比较
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